Relatório dos testes PCR de 27 de Novembro de 2020

🔊 Ouvir este texto Relatório de revisão Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020.

27 de Novembro de 2020.

Este extenso relatório de revisão foi oficialmente apresentado ao conselho editorial da Eurosurveillance a 27 de Novembro de 2020 através do seu portal de apresentação, anexo a este relatório de revisão está uma carta de pedido de retractação, assinada por todos os principais e co-autores. O primeiro e o último nomes listados são o primeiro e o segundo autores principais. Todos os nomes intermediários são co-autores.

A revisão externa por pares do teste RTPCR para detectar a SRA-CoV-2 revela 10 grandes falhas científicas a nível molecular e metodológico: consequências para resultados falsos positivos.

Pieter Borger(1), Bobby Rajesh Malhotra(2) , Michael Yeadon(3) , Clare Craig(4), Kevin McKernan(5) , Klaus Steger(6) , Paul McSheehy(7) , Lidiya Angelova(8), Fabio Franchi(9), Thomas Binder(10), Henrik Ullrich(11) , Makoto Ohashi(12), Stefano Scoglio(13), Marjolein Doesburg-van Kleffens(14), Dorothea Gilbert(15), Rainer Klement(16), Ruth Schruefer(17), Berber W. Pieksma(18), Jan Bonte(19), Bruno H. Dalle Carbonare(20), Kevin P. Corbett(21), Ulrike Kämmerer(22)

ABSTRACTO
Na publicação intitulada “Detecção do novo coronavírus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real” (Eurosurveillance 25(8) 2020) os autores apresentam um fluxo de trabalho de diagnóstico e protocolo RT-qPCR para detecção e diagnóstico de 2019-nCoV (agora conhecido como SARS-CoV-2), que afirmam ser validado, bem como uma metodologia de diagnóstico robusta para utilização em ambientes de laboratórios de saúde pública.

luz de todas as consequências resultantes desta mesma publicação para as sociedades de todo o mundo, um grupo de investigadores independentes efectuou uma revisão ponto a ponto da referida publicação, na qual 1) todos os componentes do desenho do teste apresentado foram verificados transversalmente, 2) as recomendações do protocolo RT-qPCR foram avaliadas com base nas boas práticas de laboratório, e 3) parâmetros examinados em comparação com a literatura científica relevante que cobre o campo.

O protocolo RT-qPCR publicado para detecção e diagnóstico de 2019-nCoV e o manuscrito sofrem de numerosos erros técnicos e científicos, incluindo uma concepção de primário insuficiente, um protocolo RT-qPCR problemático e insuficiente, e a ausência de uma validação precisa do teste. Nem o teste apresentado nem o próprio manuscrito preenchem os requisitos para uma publicação científica aceitável. Além disso, os graves conflitos de interesse dos autores não são mencionados. Finalmente, o prazo muito curto entre a submissão e a aceitação da publicação (24 horas) significa que um processo sistemático de revisão por pares não foi realizado aqui, ou que foi de má qualidade problemática. Fornecemos provas convincentes de várias insuficiências, erros e falhas científicas.

Considerando as falhas científicas e metodológicas aqui apresentadas, estamos confiantes de que o conselho editorial da Eurosurveillance não tem outra escolha senão retirar a publicação.

DE REVISÃO CONCISA
Este documento mostrará numerosas falhas graves no documento Corman-Drosten, cujo significado levou a um diagnóstico mundial errado das infecções atribuídas à SRA-CoV-2 e associadas à doença COVID-19. Estamos confrontados com bloqueios rigorosos que destruíram a vida e a subsistência de muitas pessoas, acesso limitado à educação e estas restrições impostas pelos governos de todo o mundo constituem um ataque directo aos direitos básicos das pessoas e às suas liberdades pessoais, resultando em danos colaterais para economias inteiras a uma escala global.

Existem dez problemas fatais com o documento Corman-Drosten que iremos delinear e explicar em maior detalhe nas secções seguintes.

A primeira e principal questão é que o novo Coronavirus SARS-CoV-2 (na publicação denominada 2019-nCoV e em Fevereiro de 2020 denominada SARS-CoV-2 por um consórcio internacional de peritos em vírus) se baseia em sequências (teóricas), fornecidas por um laboratório na China [1], porque na altura nem o material de controlo do material infeccioso (“vivo”) ou inactivado do SARS-CoV-2 nem o RNA genómico isolado do vírus estavam à disposição dos autores. Até à data, nenhuma validação foi efectuada pela autoria com base em vírus isolados do SARS-CoV-2 ou RNA de comprimento total do mesmo. De acordo com Corman et al:

“O nosso objectivo era desenvolver e implementar uma metodologia de diagnóstico robusta para utilização em laboratórios de saúde pública sem ter material viral disponível”. [1]

O foco aqui deve ser colocado nos dois objectivos declarados: a) desenvolvimento e b) implementação de um teste de diagnóstico para utilização em laboratórios de saúde pública. Estes objectivos não podem ser alcançados sem que se disponha de qualquer material viral real (por exemplo, para determinar a carga viral infecciosa). Em qualquer caso, apenas um protocolo com a máxima precisão pode ser o objectivo obrigatório e primário em qualquer cenário – resultado desta magnitude. A determinação da carga viral crítica é informação obrigatória, e é da responsabilidade do grupo Christian Drosten realizar estas experiências e fornecer os dados cruciais.

No entanto, estas sequências em silico foram utilizadas para desenvolver uma metodologia de teste RT-PCR para identificar o vírus supracitado. Este modelo foi baseado no pressuposto de que o novo vírus é muito semelhante ao SARS-CoV de 2003, uma vez que ambos são beta-coronavírus.

O teste PCR foi portanto concebido utilizando a sequência genómica do SRA-CoV como material de controlo para o componente Sarbeco; sabemos isto através da nossa comunicação pessoal por correio electrónico com [2] um dos co-autores do artigo Corman-Drosten. Este método para modelizar a SRA-CoV-2 foi descrito no documento Corman-Drosten como se segue:

“o estabelecimento e validação de um fluxo de trabalho de diagnóstico para o rastreio de 2019-nCoV e confirmação específica, concebido na ausência de isolados de vírus disponíveis ou amostras originais de pacientes. A concepção e validação foram possibilitadas pela estreita relação genética com o SRA-CoV 2003, e auxiliadas pela utilização da tecnologia de ácido nucleico sintético”.

A Reacção de Transcrição Reversa-Polimerase em Cadeia (RT-PCR) é uma tecnologia biomolecular importante para detectar rapidamente fragmentos raros de RNA, que são conhecidos antecipadamente. No primeiro passo, as moléculas de RNA presentes na amostra são transcritas ao contrário para produzir cDNA. O cDNA é então amplificado na reacção em cadeia da polimerase utilizando um par de iniciadores específico e uma enzima termoestável de DNA polimerase. A tecnologia é altamente sensível e o seu limite de detecção é teoricamente 1 molécula de cDNA. A especificidade da PCR é altamente influenciada por erros de concepção biomolecular.

O que é importante ao conceber um teste RT-PCR e o teste quantitativo RT-qPCR descrito na publicação Corman-Drosten?
1. Os primários e as sondas:
a) a concentração de iniciadores e sondas deve ser da gama ideal
(100-200 nM)
b) deve ser específico para o gene alvo que se pretende amplificar
c) deve ter uma percentagem óptima de teor de GC em relação ao total de bases azotadas (mínimo 40%, máximo 60%)
d) para o diagnóstico de vírus, pelo menos 3 pares de primers devem detectar 3 genes virais (de preferência o mais afastados possível no genoma viral)

2. A temperatura a que todas as reacções têm lugar:
a) Temperatura de fusão do ADN (>92°)
b) Temperatura de amplificação de ADN (específico TaqPol)
c) Tm; a temperatura de recozimento (a temperatura a que os primários e as sondas atingem a ligação/desacoplamento alvo, não deve exceder 2 ̊C por par de primários). Tm depende muito do conteúdo de GC dos iniciadores

3. O número de ciclos de amplificação (menos de 35; de preferência 25-30 ciclos);
Em caso de detecção de vírus, >35 ciclos apenas detecta sinais que não se correlacionam com vírus infecciosos, conforme determinado pelo isolamento em cultura celular [revisto em 2]; se alguém for testado por PCR como positivo quando é utilizado um limiar de 35 ciclos ou superior (como é o caso na maioria dos laboratórios na Europa e nos EUA), a probabilidade de essa pessoa ser infectada é inferior a 3%, a probabilidade de esse resultado ser um falso positivo é de 97% [revisto em 3].

4. Validações biológicas moleculares; os produtos PCR amplificados devem ser validados quer através da execução dos produtos num gel com uma régua de ADN, quer através da sequenciação directa do ADN
5. Os controlos positivos e negativos devem ser especificados para confirmar/refutar a detecção de vírus específicos
6. Deve haver um Procedimento Operacional Padrão (PON) disponível

SOP especifica inequivocamente os parâmetros acima mencionados, de modo a que todos os laboratórios sejam capazes de estabelecer exactamente as mesmas condições de teste. Ter um POP universal validado é essencial, porque permite a comparação de dados dentro e entre países.

PEQUENAS PREOCUPAÇÕES COM O PAPEL CORMAN-DROSTEN
1. Na Tabela 1 do papel Corman-Drosten, são indicadas abreviaturas diferentes – “nM” é especificado, “nm” não é. Além disso, no que diz respeito à nomenclatura correcta, nm significa “nanómetro”, pelo que nm deve ler-se nM aqui.

2. É consenso geral a escrita de sequências genéticas sempre na direcção 5′-3′, incluindo os iniciadores invertidos. É altamente invulgar fazer o alinhamento com a escrita complementar inversa da sequência de primers, como os autores fizeram na figura 2 do papel Corman-Drosten. Aqui, para além disso, uma base oscilante é marcada como “y” sem descrição das bases que o Y representa.

3. Duas armadilhas enganadoras no papel Corman-Drosten são que a sua Tabela 1 não inclui valores Tm (valores de recozimento-temperatura), nem mostra valores GC (número de G e C nas sequências como % do valor total das bases).

PRINCIPAIS PREOCUPAÇÕES COM O PAPEL CORMAN-DROSTEN

A) ANTECEDENTES
Os autores apresentam os antecedentes do seu trabalho científico como: “O surto em curso do novo coronavírus (2019-nCoV) recentemente surgido constitui um desafio para os laboratórios de saúde pública, uma vez que os isolados de vírus não estão disponíveis, enquanto há provas crescentes de que o surto é mais generalizado do que inicialmente se pensava, e a propagação internacional através dos viajantes já se verifica”.

Segundo a BBC News [4] e Google Statistics [5] houve 6 mortes em todo o mundo a 21 de Janeiro de 2020 – o dia em que o manuscrito foi submetido. Porque é que os autores assumiram um desafio para os laboratórios de saúde pública, quando na altura não havia provas substanciais que indicassem que o surto estava mais disseminado do que inicialmente se pensava?

Como objectivo, os autores declararam desenvolver e implementar uma metodologia de diagnóstico robusta para utilização em laboratórios de saúde pública sem ter material viral disponível. Além disso, reconhecem que “o presente estudo demonstra a enorme capacidade de resposta alcançada através da coordenação de laboratórios académicos e públicos em redes de investigação nacionais e europeias”.

B) MÉTODOS E RESULTADOS

1. Desenho de Primário e Sonda
1a) Concentrações de primários errados
Os protocolos de teste PCR fiáveis e precisos são normalmente concebidos utilizando entre 100 nM e 200 nM por iniciador [7]. No papel Corman-Drosten, observamos concentrações de iniciadores anormalmente elevadas e variáveis para vários iniciadores (quadro 1). Para os pares de primários RdRp_SARSr-F e RdRp_SARSr-R, 600 nM e 800 nM são descritos, respectivamente. Do mesmo modo, para o conjunto de primários N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R, aconselham 600 nM e 800 nM, respectivamente [1].

Deve ficar claro que estas concentrações são demasiado elevadas para serem óptimas para amplificações específicas dos genes alvo. Não existe qualquer razão especificada para utilizar estas concentrações extremamente elevadas de iniciadores neste protocolo. Pelo contrário, estas concentrações levam ao aumento da ligação não específica e à amplificação do produto PCR.

Quadro1: Primários e sondas (adaptados de papel Corman-Drosten; as concentrações de primers erradas são destacadas)

1b) Primário não especificado (“Wobbly”) e sequências de sondas
Para obter resultados reprodutíveis e comparáveis, é essencial definir distintamente os pares de primários. No papel Corman-Drosten observámos seis posições não especificadas, indicadas pelas letras R, W, M e S (Tabela 2). A letra W significa que nesta posição pode haver ou um A ou um T; R significa que pode haver ou um G ou um A; M indica que a posição pode ser um A ou um C; a letra S indica que pode haver ou um G ou um C nesta posição.

Este elevado número de variantes não só é invulgar, como também é altamente confuso para os laboratórios. Estas seis posições não especificadas poderiam facilmente resultar na concepção de várias sequências de iniciadores alternativos diferentes que não se relacionam com a SRA-CoV-2 (2 iniciadores RdRp_SARSr_F distintos + 8 sondas RdRp_SARS_P1 distintas + 4 sondas RdRp_SARSr_R distintas). As variações de concepção conduzirão inevitavelmente a resultados que nem sequer estão relacionados com o SARS CoV-2. Portanto, a confusa descrição não específica no papel Corman-Drosten não é adequada como Protocolo Operacional Padrão. Estas posições não especificadas deveriam ter sido concebidas de forma inequívoca.

Estas sequências instáveis já criaram uma fonte de preocupação no terreno e resultaram numa Carta ao Editor redigida por Pillonel et al. [8] sobre erros flagrantes nas sequências descritas. Estes erros são também evidentes no suplemento de Corman et al.

Quadro 2: Primers e sondas (adaptados do papel Corman-Drosten; os nucleótidos não especificados (“Wobbly”) nos primers são destacados)

O protocolo da OMS, que deriva directamente do documento Corman-Drosten, conclui que, para confirmar a presença da SRA-CoV-2, dois genes de controlo (o E e o RdRp-genes) devem ser identificados no ensaio. É de notar que o gene RdPd- tem uma posição incerta (“wobbly”) no filtro da frente (R=G/A), duas posições incertas no filtro da frente (R=G/A; S=G/C) e tem três posições incertas na sonda RdRp (W=A/T; R=G/A; M=A/C). Assim, podem ser sintetizados dois primários diferentes para a frente, quatro primários diferentes para trás, e oito sondas distintas para o gene de RdPd-. Juntas, há 64 combinações possíveis de iniciadores e sondas!

O papel Corman-Drosten identifica ainda um terceiro gene que, de acordo com o protocolo da OMS, não foi mais validado e considerado desnecessário:

“De notar que o ensaio do gene N também teve um bom desempenho mas não foi sujeito a uma validação mais intensiva porque foi ligeiramente menos sensível”.

Esta foi uma omissão infeliz, pois seria melhor utilizar os três PCRs de genes como ensaios de confirmação, e isto teria resultado num protocolo quase suficiente de instrumento de diagnóstico de RNA de detecção de vírus. Três passos de ensaio de confirmação minimizariam pelo menos os erros e incertezas em cada passo em relação aos pontos de “Wobbly”. (No entanto, o protocolo ainda ficaria aquém de qualquer “boa prática de laboratório”, quando se tem em conta todos os outros erros de concepção).

Na sua forma actual, o ensaio do gene N infelizmente não é proposto na recomendação da OMS (Figura 1) como uma terceira etapa de confirmação obrigatória e crucial, nem é enfatizado no documento Corman-Drosten como importante garantia opcional “para um fluxo de trabalho de rotina” (Quadro 2).

Consequentemente, em quase todos os procedimentos de teste em todo o mundo, foram utilizados apenas 2 primários em vez de todos os três. Este lapso torna todo o protocolo de teste inútil no que diz respeito à entrega de resultados de teste precisos de significado real numa pandemia em curso.

Figura 1: O ensaio de confirmação do N-Gene não é enfatizado como terceiro passo necessário na recomendação oficial do protocolo Drosten-Corman da OMS abaixo [8] nem é exigido como passo crucial para uma maior exactidão dos testes na publicação da Eurosurveillance.

1c) Conteúdo de CG errado (discutido em 2c, juntamente com a temperatura de recozimento (Tm))
1d) Detecção de genes virais
RT-PCR não é recomendado para o diagnóstico primário de infecção. É por isso que o Teste RT-PCR utilizado na rotina clínica para a detecção da COVID-19 não é indicado para o diagnóstico da COVID-19 numa base regulamentar.

“Os médicos precisam de reconhecer a maior precisão e rapidez das técnicas de diagnóstico molecular para o diagnóstico de infecções, mas também de compreender as suas limitações. Os resultados laboratoriais devem ser sempre interpretados no contexto da apresentação clínica do paciente, e são necessários um local, qualidade e tempo adequados para a colheita de amostras para que os resultados dos testes sejam fiáveis”. [9]

No entanto, pode ser utilizado para ajudar no diagnóstico diferencial do médico quando este tem de discriminar entre diferentes infecções pulmonares (Gripe, Covid-19 e SRA têm sintomas muito semelhantes). Para um diagnóstico confirmativo de um vírus específico, devem ser aplicados pelo menos 3 pares de primers específicos para detectar 3 genes específicos do vírus. De preferência, estes genes alvo devem ser localizados com a maior distância possível no genoma viral (extremidades opostas incluídas).

Embora o papel Corman-Drosten descreva 3 iniciadores, estes iniciadores cobrem apenas cerca de metade do genoma do vírus. Este é outro factor que diminui a especificidade da detecção do RNA intacto do vírus COVID-19 e aumenta a citação de resultados de testes falsos positivos.

Portanto, mesmo que obtenhamos três sinais positivos (ou seja, os três pares de iniciadores dão 3 produtos de amplificação diferentes) numa amostra, isto não prova a presença de um vírus. Um melhor desenho do primer teria primers terminais em ambas as extremidades do genoma viral. Isto porque todo o genoma viral seria coberto e três sinais positivos podem discriminar melhor entre um vírus completo (e portanto potencialmente infeccioso) e genomas virais fragmentados (sem potência infecciosa). A fim de inferir algo de significativo sobre a infecciosidade do vírus, o gene Orf1, que codifica a enzima essencial da replicase dos vírus SRA-CoV, deveria ter sido incluído como um alvo (Figura 2). O posicionamento dos alvos na região do genoma viral que é mais pesado e transcrito de forma variável é outra fraqueza do protocolo.

Kim et al. demonstram uma expressão altamente variável de 3′ de RNA subgenómico em Sars-CoV-2 [23]. Estes RNA são activamente monitorizados como assinaturas de doentes assintomáticos e não infecciosos [10]. É altamente duvidoso rastrear uma população de pessoas assintomáticas com iniciadores qPCR que têm 6 pares de bases de iniciadores-dímeros na extremidade 3 primária de um iniciador (Figura 3).
Aparentemente, a OMS recomenda estes iniciadores. Testamos todos os derivados da oscilação do papel Corman-Drosten com a ferramenta de iniciador dimer da web da Thermofisher [11]. O primer RdRp forward primer tem 6bp 3prime homology com Sarbeco E Reverse. Em altas concentrações de primário, isto é suficiente para criar imprecisões.

Nota: Há uma correspondência perfeita de um dos iniciadores N com um patogéneo clínico (Pantoea), encontrado em doentes imunocomprometidos. O iniciador invertido atinge também a Pantoea, mas não na mesma região.

Estes são erros graves de concepção, uma vez que o teste não pode discriminar entre o vírus inteiro e os fragmentos virais. O teste não pode ser utilizado como diagnóstico para os vírus da SRA.

Posições relativas dos alvos amplicon no vírus corona da SRA e no novo genoma do vírus corona de 2019. ORF: quadro de leitura aberto; RdRp: RNA polimerase dependente do RNA. Os números abaixo de amplicon são posições do genoma de acordo com SARS-CoV, NC_004718 [1];

Um teste com a ferramenta de iniciador de dímeros Thermofischer revela que o iniciador de RdRp para a frente tem uma homologia de 6bp 3`prime com Sarbeco E Reverse (caixa esquerda). Outro teste revela que existe uma correspondência perfeita para um dos N-primers com um patogéneo clínico (Pantoea) encontrado em doentes imunocomprometidos (caixa direita).

2. Temperaturas de reacção
2a) Temperatura de fusão do ADN (>92°).
Adequadamente abordado no papel Corman-Drosten.

2b) Temperatura de amplificação de ADN.
Adequadamente abordada no papel Corman-Drosten.

2c) Conteúdos GC errados e Tm
A temperatura de recozimento determina a que temperatura o primário se liga/desliga a partir da sequência alvo. Para uma amplificação eficiente e específica, o conteúdo de GC dos primários deve cumprir um mínimo de 40% e um máximo de 60% de amplificação. Como indicado na tabela 3, três dos iniciadores descritos no papel Corman-Drosten não se encontram dentro da gama normal para o conteúdo de GC. Dois primários (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) têm valores de GC invulgares e muito baixos de 28%-31% para todas as variantes possíveis de bases oscilantes, enquanto que o primário E_Sarbeco_F tem um valor de GC de 34,6% (Tabela 3 e segundo painel da Tabela 3).

De notar que o conteúdo de GC determina em grande parte a ligação ao seu objectivo específico devido às suas três ligações de hidrogénio em emparelhamento de bases. Assim, quanto menor for o conteúdo de GC do primário, menor será a sua capacidade de ligação à sua sequência genética alvo específica (ou seja, o gene a ser detectado). Isto significa que para que uma sequência alvo seja reconhecida, temos de escolher uma temperatura o mais próxima possível da temperatura de recozimento real (valor de melhores práticas) para que o iniciador não se desprenda novamente, ao mesmo tempo que seleccionamos especificamente a sequência alvo.

Se o valor Tm for muito baixo, como observado para todas as variantes oscilantes dos iniciadores inversos da RdRp, os iniciadores podem ligar-se não especificamente a vários alvos, diminuindo a especificidade e aumentando os potenciais resultados falsos positivos.

A temperatura de recozimento (Tm) é um factor crucial para a determinação da especificidade/actualidade do procedimento qPCR e essencial para a avaliação da exactidão dos protocolos qPCR. Recomendação de melhores práticas: Ambos os primários (para a frente e para trás) devem ter um valor quase semelhante, de preferência o valor idêntico.

Utilizámos o software de desenho de primários livremente disponível Primer-BLAST [12, 25] para avaliar os valores das melhores práticas para todos os primários utilizados no papel Corman-Drosten (Tabela 3). Tentámos encontrar um valor Tm de 60° C, ao mesmo tempo que procurámos o valor mais elevado possível de GC% para todos os primários. Uma diferença máxima de Tm de 2° C dentro dos pares de primários foi considerada aceitável. Testando os pares de iniciadores especificados no papel Corman-Drosten, observámos uma diferença de 10° C em relação à temperatura de recozimento Tm para o par de iniciadores1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R). Este é um erro muito grave e torna o protocolo inútil como ferramenta de diagnóstico específica.

Testes adicionais demonstraram que apenas o par de iniciadores concebido para amplificar o N-gene (N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R) atingiu o padrão adequado para funcionar num teste de diagnóstico, uma vez que tem um conteúdo de GC suficiente e a diferença Tm entre os iniciadores (N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R) é de 1,85° C (abaixo do máximo crucial de 2° C de diferença). Importante, este é o gene que não foi testado nas amostras de vírus (Quadro 2) nem enfatizado como teste de confirmação. Além de temperaturas de fusão altamente variáveis e sequências degeneradas nestes iniciadores, há outro factor com impacto na especificidade do procedimento: os dNTPs (0,4uM) são 2x mais elevados do que o recomendado para uma amplificação altamente específica. Há também sulfato de magnésio adicional adicionado à reacção. Este procedimento combinado com uma baixa temperatura de recozimento pode criar amplificações não específicas. Quando é necessário magnésio adicional para qPCR, a especificidade do ensaio deve ser examinada mais detalhadamente.

Os erros de concepção aqui descritos são tão graves que é altamente improvável que a amplificação específica do material genético do SRA-CoV-2 ocorra utilizando o protocolo do papel Corman-Drosten.
Tabela 3: Conteúdo de GC dos primários e sondas (adaptado do papel Corman-Drosten; as aberrações do conteúdo optimizado de GC são realçadas. O segundo painel mostra uma lista de tabela de todos os valores das melhores práticas do Primer-BLAST para todos os primários e sondas utilizados no papel Corman-Drosten pela Prof. Dra. Ulrike Kämmerer & a sua equipa

3. O número de ciclos de amplificação
Deve notar-se que não há qualquer menção no papel Corman-Drosten de um teste ser positivo ou negativo, ou mesmo o que define um resultado positivo ou negativo. Estes tipos de testes de diagnóstico virológico devem basear-se num SOP, incluindo um número validado e fixo de ciclos de PCR (valor Ct) após o qual uma amostra é considerada positiva ou negativa. O valor máximo de Ct razoavelmente fiável é de 30 ciclos. Acima de um Ct de 35 ciclos, devem ser esperados números rapidamente crescentes de falsos positivos.

Os dados PCR avaliados como positivos após um valor Ct de 35 ciclos não são completamente fiáveis.

Citando Jaafar et al. 2020 [3]: “Em Ct = 35, o valor que utilizámos para reportar um resultado positivo para a PCR, <3% das culturas são positivas”. Por outras palavras, não houve isolamento bem sucedido do vírus da SRA-CoV-2 a esses valores elevados de Ct.

Além disso, estudos científicos mostram que apenas os vírus não infecciosos (mortos) são detectados com valores de Ct de 35 [22].

Entre 30 e 35 existe uma área cinzenta, onde um teste positivo não pode ser estabelecido com certeza. Esta área deve ser excluída. Claro que se poderia realizar 45 ciclos de PCR, como recomendado no protocolo Corman-Drosten da OMS (Figura 4), mas também é necessário definir um valor Ct razoável (que não deve exceder 30). Mas um resultado analítico com um valor Ct de 45 não tem qualquer significado científico e diagnóstico (um valor Ct razoável não deve exceder 30). Tudo isto deve ser comunicado de forma muito clara. É um erro significativo que o papel Corman-Drosten não mencione o valor máximo Ct ao qual uma amostra pode ser inequivocamente considerada como um resultado de teste positivo ou negativo. Este importante limite de ciclo também não é especificado em quaisquer apresentações de seguimento até à data.

Recomendação do Kit RT-PCR no protocolo oficial Corman-Drosten da OMS [8]. Apenas um valor “Cycler” (ciclos) pode ser encontrado sem Ct (Cutoff-value) correspondente e cientificamente razoável. Este ou qualquer outro valor de ciclo não se encontra em parte alguma no próprio papel Corman-Drosten.

4. Validações biomoleculares
Para determinar se os produtos amplificados são de facto genes SRA-CoV-2, é essencial a validação biomolecular dos produtos PCR amplificados. Para um teste de diagnóstico, esta validação é um imperativo absoluto.

A validação dos produtos PCR deve ser executada executando o produto PCR num gel de 1% agarose-EtBr juntamente com um indicador de tamanho (régua de ADN ou escada de ADN) para que o tamanho do produto possa ser estimado. O tamanho deve corresponder ao tamanho calculado do produto de amplificação. Mas é ainda melhor sequenciar o produto de amplificação. Este último dará 100% de certeza sobre a identidade do produto de amplificação. Sem validação molecular não se pode ter a certeza sobre a identidade dos produtos de amplificação PCR. Considerando os graves erros de concepção descritos anteriormente, os produtos amplificados de PCR podem ser qualquer coisa.

Também não mencionado no papel Corman-Drosten é o caso de pequenos fragmentos de qPCR (cerca de 100bp): Pode ser 1,5% de gel de agarose ou mesmo um gel de acrilamida.

O facto de estes produtos PCR não terem sido validados a nível molecular é outro erro marcante do protocolo, tornando inútil qualquer teste baseado nele como ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

5. Controlos positivos e negativos para confirmar/refutar a detecção de vírus específicos.
A hipótese não confirmada descrita no documento Corman-Drosten é que o SRA-CoV-2 é o único vírus do grupo beta-coronavírus tipo SRA que actualmente causa infecções em humanos. As sequências em que se baseia o seu método PCR estão em sequências silicas, fornecidas por um laboratório na China [23], porque no momento do desenvolvimento do teste PCR não havia material de controlo de infecções (“vivas”) ou SRA-CoV-2 inactivado à disposição dos autores. O teste PCR foi portanto concebido utilizando a sequência do conhecido SARS-CoV como material de controlo para o componente Sarbeco (Dr. Meijer, co-autor do papel Corman-Drosten numa troca de correio electrónico com o Dr. Peter Borger) [2].

Presume-se que todos os indivíduos que apresentem resultados positivos no teste RT-PCR, como descrito no papel Corman-Drosten, sejam positivos para infecções da SRA-CoV-2. Há três falhas graves na sua suposição. Primeiro, um teste positivo para as moléculas de RNA descritas no papel Corman-Drosten não pode ser equiparado a “infecção com um vírus”. Um teste RT-PCR positivo apenas indica a presença de moléculas virais de RNA. Como demonstrado no ponto 1d (acima), o teste Corman-Drosten não foi concebido para detectar o vírus a todo o comprimento, mas apenas um fragmento do vírus. Já concluímos que isto classifica o teste como impróprio como um teste de diagnóstico
para infecções por SRA-vírus.

Em segundo lugar e de grande relevância, a funcionalidade do Teste RT-PCR publicado não foi demonstrada com a utilização de um controlo positivo (RNA SRA-CoV-2 isolado), que é um padrão de ouro científico essencial.

Terceiro, o papel Corman-Drosten afirma:

“Para mostrar que os ensaios podem detectar outros vírus relacionados com a SRA associados a morcegos, utilizámos o ensaio do gene E para testar seis amostras de fezes derivadas de morcegos disponíveis em Drexler et al. […] und Muth et al. […]. Estas amostras positivas para o vírus provêm de morcegos rinolófilos europeus. A detecção destes outliers filogenéticos dentro do clade CoV relacionado com a SRA sugere que todos os vírus asiáticos são susceptíveis de serem detectados. Isto asseguraria, teoricamente, uma ampla sensibilidade mesmo no caso de múltiplas aquisições independentes de vírus variantes a partir de um reservatório animal”.

Esta afirmação demonstra que o gene E utilizado no teste RT-PCR, tal como descrito no documento Corman-Drosten, não é específico da SRA-CoV-2.

Os iniciadores do gene E também detectam um amplo espectro de outros vírus da SRA.
O genoma do coronavírus é o maior de todos os vírus RNA que infectam humanos e todos eles têm uma estrutura molecular muito semelhante. Ainda assim, o SARS-CoV1 e o SARS-CoV-2 têm duas impressões digitais genéticas altamente específicas, o que os distingue dos outros vírus corona. Primeiro, uma sequência única de impressões digitais (KTFPPTEPKKKDKKKK) está presente na proteína N da SRA-CoV e SRA-CoV-2 [13,14,15]. Em segundo lugar, tanto o SARS-CoV1 como o SARS-CoV2 não contêm a proteína HE, enquanto que todos os outros vírus corona possuem este gene [13,14]. Assim, a fim de detectar especificamente um produto PCR SRA-CoV1 e SRA-CoV-2, a região acima referida no gene N deveria ter sido escolhida como alvo de amplificação. Um teste de diagnóstico fiável deveria concentrar-se nesta região específica do gene N como teste de confirmação. A PCR para este gene N não foi mais validada nem recomendada como gene de teste pelo Drosten-Corman, devido a ser “não tão sensível” com a sonda original da SRA-CoV [1].

Além disso, a ausência do gene HE tanto no SARS-CoV1 como no SARS-CoV-2 faz deste gene o controlo negativo ideal para excluir outros coronavírus. O papel Corman-Drosten não contém este controlo negativo, nem contém quaisquer outros controlos negativos. O teste PCR no papel Corman-Drosten não contém, portanto, nem um controlo positivo único nem um controlo negativo para excluir a presença de outros vírus corona. Esta é outra grande falha de concepção que classifica o teste como impróprio para o diagnóstico.

6. O Procedimento Operacional Padrão (PON) não está disponível

Deve haver um Procedimento Operacional Padrão (PON) disponível, que especifica inequivocamente os parâmetros acima referidos, para que todos os laboratórios possam estabelecer as mesmas condições de ensaio. Ter um PON universal validado é essencial, porque facilita a comparação de dados dentro e entre países. É muito importante especificar inequivocamente todos os parâmetros primários. Notamos que isto não foi feito. Além disso, o valor Ct para indicar quando uma amostra deve ser considerada positiva ou negativa não é especificado. Também não é especificado quando uma amostra é considerada infectada com vírus SRA-CoV. Como foi demonstrado acima, o teste não consegue discernir entre vírus e fragmentos de vírus, pelo que o valor Ct que indica a positividade é de importância crucial. Este valor Ct deveria ter sido especificado no Procedimento Operacional Padrão (SOP) e colocado em linha para que todos os laboratórios que realizam este teste tenham exactamente as mesmas condições-limite. Aponta para uma ciência deficiente que um tal PON não existe. Os laboratórios são assim livres de realizar o teste como considerarem apropriado, resultando numa enorme quantidade de variação. Os laboratórios de toda a Europa ficam com uma multiplicidade de questões; que cartilhas encomendar? que nucleótidos preencher os lugares indefinidos? que valor Tm escolher? Quantos ciclos de PCR devem ser executados? Com que valor Ct a amostra é positiva? E quando é negativa? E quantos genes a testar? Todos os genes devem ser testados, ou apenas o gene E e RpRd como mostra a tabela 2 do papel Corman-Drosten? O gene N também deve ser testado? E qual é o seu controlo negativo? Qual é o seu controlo positivo?

O protocolo, tal como descrito, é infelizmente muito vago e erróneo na sua concepção, que se pode ir em dezenas de direcções diferentes. Não parece haver qualquer padronização nem um SOP, pelo que não é claro como este teste pode ser implementado.

7. Consequências dos erros descritos em 1-5: falsos resultados positivos.

O teste RT-PCR descrito no papel Corman-Drosten contém tantos erros de concepção biológica molecular (ver 1-5) que não é possível obter resultados inequívocos. É inevitável que este teste venha a gerar um número tremendo dos chamados “falsos positivos”. A definição de falsos positivos é uma amostra negativa, que inicialmente tem uma pontuação positiva, mas que é negativa após o novo teste com o mesmo teste. Os falsos positivos são resultados errados de testes positivos, ou seja, amostras negativas que testam positivo. E isto é de facto o que se encontra no papel Corman-Drosten. Na página 6 do manuscrito PDF os autores demonstram, que mesmo sob condições laboratoriais bem controladas, uma percentagem considerável de falsos positivos é gerada com este teste:

“Em quatro reacções individuais de teste, foi observada uma fraca reactividade inicial, no entanto, estas foram negativas após o novo teste com o mesmo ensaio. Estes sinais não foram associados a nenhum vírus em particular, e para cada vírus com o qual a reactividade inicial positiva ocorreu, havia outras amostras que continham o mesmo vírus numa concentração mais elevada mas que não testaram positivo. Dados os resultados da extensa qualificação técnica descrita acima, concluiu-se que esta reactividade inicial não se devia à instabilidade química das sondas de PCR em tempo real e muito provavelmente ao tratamento de problemas causados pela rápida introdução de novos testes de diagnóstico e controlos durante este estudo de avaliação”. [1]

A primeira frase deste excerto é uma prova clara de que o teste PCR descrito no papel Corman-Drosten gera falsos positivos. Mesmo sob as condições bem controladas do Laboratório Charité de última geração, 4 dos 310 testes primários são falsos positivos por definição. Quatro amostras negativas inicialmente testadas positivas, depois foram negativas no novo teste. Este é o exemplo clássico de um falso positivo. Neste caso, os autores não os identificam como falsos positivos, o que é intelectualmente desonesto.

Outra observação reveladora no excerto acima é que os autores explicam os falsos positivos como “problemas de tratamento causados pela rápida introdução de novos testes de diagnóstico”. Imagine os laboratórios que têm de introduzir o teste sem toda a informação necessária normalmente descrita num PON.

8. O papel Corman-Drosten não foi revisto por pares.

Antes da publicação formal numa revista académica, os artigos científicos e médicos são tradicionalmente certificados por “revisão por pares”. Neste processo, os editores da revista recebem conselhos de vários peritos (“referees”) que avaliaram o artigo e podem identificar pontos fracos nos seus pressupostos, métodos, e conclusões. Normalmente, uma revista só publicará um artigo quando os editores estiverem convencidos de que os autores abordaram as preocupações dos árbitros e que os dados apresentados apoiam as conclusões tiradas no artigo”. Este processo é tão bem descrito para a Eurovigilância [16].

O artigo Corman-Drosten foi submetido à Eurosurveillance a 21 de Janeiro de 2020 e aceite para publicação a 22 de Janeiro de 2020. No dia 23 de Janeiro de 2020, o documento estava online. A 13 de Janeiro de 2020, a versão 1-0 do protocolo foi publicada no website oficial da OMS [17], actualizada a 17 de Janeiro de 2020 como documento versão 2-1 [18], mesmo antes da publicação do documento Corman-Drosten a 23 de Janeiro no Eurosurveillance.

Normalmente, a revisão pelos pares é um processo moroso, uma vez que pelo menos dois peritos da área têm de ler e comentar criticamente o documento apresentado. Na nossa opinião, este documento não foi objecto de revisão por pares. Vinte e quatro horas são simplesmente insuficientes para levar a cabo uma revisão por pares. A nossa conclusão é apoiada pelo facto de termos encontrado um número enorme de falhas de concepção muito graves, que tornam o teste PCR completamente inadequado como instrumento de diagnóstico para identificar o vírus SARS-CoV-2. Qualquer biólogo molecular familiarizado com a concepção da RT-PCR teria facilmente observado os graves erros presentes no papel Corman-Drosten antes do processo de revisão propriamente dito. Pedimos à Eurosurveillance no dia 26 de Outubro de 2020 para nos enviar uma cópia do relatório de revisão pelos pares. Até à data, não recebemos este relatório e, numa carta datada de 18 de Novembro de 2020, o CEPCD como anfitrião da Eurovigilância recusou-se a facultar o acesso sem apresentar razões científicas substanciais para a sua decisão. Pelo contrário, eles escrevem que “a divulgação prejudicaria o objectivo das investigações científicas”. [24].

9. Autores como os editores

Um último ponto é uma das maiores preocupações. Acontece que dois autores do jornal Corman-Drosten, Christian Drosten e Chantal Reusken, são também membros do conselho editorial desta revista [19]. Por conseguinte, existe um grave conflito de interesses que reforça as suspeitas de que o artigo não foi revisto por pares. Parece que a publicação rápida foi possível simplesmente porque os autores também fizeram parte do conselho editorial da Eurosurveillance. Esta prática é classificada como comprometendo a integridade científica.

CATÁLOGO SUMÁRIO DOS ERROS ENCONTRADOS NO ARTIGO
O papel Corman-Drosten contém os seguintes erros específicos:

1. Não existe qualquer razão especificada para utilizar estas concentrações extremamente elevadas de primários neste protocolo. As concentrações descritas levam ao aumento de ligações não específicas e amplificações de produtos PCR, tornando o teste inadequado como instrumento de diagnóstico específico para identificar o vírus SARS-CoV-2.

2. Seis posições oscilantes não especificadas introduzirão uma enorme variabilidade nas implementações deste teste no mundo real; a descrição confusa não específica no papel Corman-Drosten não é adequada como Protocolo Operacional Padrão tornando o teste inadequado como ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SRA-CoV-2.

3. O teste não pode discriminar entre o vírus inteiro e os fragmentos virais. Portanto, o teste não pode ser utilizado como diagnóstico para vírus intactos (infecciosos), tornando o teste inadequado como ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SRA-CoV-2 e fazer inferências sobre a presença de uma infecção.

4. Uma diferença de 10° C em relação à temperatura de recozimento Tm para o par de primário1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) também torna o teste inadequado como ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SRA-CoV-2.

5. Um erro grave é a omissão de um valor Ct em que uma amostra é considerada positiva e negativa. Este valor Ct também não é encontrado nas apresentações de acompanhamento, tornando o teste inadequado como ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SRA-CoV-2.

6. Os produtos PCR não foram validados a nível molecular. Este facto torna o protocolo inútil como ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SRA-CoV-2.

7. O teste PCR não contém um controlo positivo único para avaliar a sua especificidade para a SRA-CoV-2 nem um controlo negativo para excluir a presença de outros vírus corona, tornando o teste inadequado como instrumento de diagnóstico específico para identificar o vírus SRA-CoV-2.

8. O desenho do teste no papel Corman-Drosten é tão vago e imperfeito que se pode ir em dezenas de direcções diferentes; nada é padronizado e não existe um SOP. Isto põe em causa a validade científica do teste e torna-o inadequado como instrumento de diagnóstico específico para identificar o vírus SRA-CoV-2.

9. Muito provavelmente, o papel Corman-Drosten não foi revisto por pares tornando o teste inadequado como instrumento de diagnóstico específico para identificar o vírus SRA-CoV-2.

10. Encontramos graves conflitos de interesse para pelo menos quatro autores, para além do facto de dois dos autores do artigo Corman-Drosten (Christian Drosten e Chantal Reusken) serem membros do conselho editorial da Eurosurveillance. Um conflito de interesses foi acrescentado a 29 de Julho de 2020 (Olfert Landt é CEO da TIB-Molbiol; Marco Kaiser é investigador sénior da GenExpress e serve como conselheiro científico da TIB-Molbiol), que não foi declarado na versão original (e ainda está ausente na versão PubMed); TIB-Molbiol é a empresa que foi “a primeira” a produzir kits PCR (Light Mix) com base no protocolo publicado no manuscrito Corman-Drosten, e de acordo com as suas próprias palavras, distribuíram estes kits de teste PCR antes mesmo de a publicação ser submetida [20]; além disso, Victor Corman & Christian Drosten não mencionou a sua segunda filiação: o laboratório de testes comerciais “Labor Berlin”. Ambos são responsáveis pelo diagnóstico do vírus [21] e a empresa opera no domínio dos testes de PCR em tempo real.

À luz do nosso reexame do protocolo de teste para identificar a SRA-CoV-2 descrito no documento Corman-Drosten, identificámos erros e falácias inerentes que tornam o teste PCR da SRA-CoV-2 inútil.

CONCLUSÃO
A decisão sobre quais os protocolos de teste que são publicados e amplamente disponibilizados está directamente nas mãos da Eurovigilância. A decisão de reconhecer os erros aparentes no papel Corman-Drosten tem o benefício de minimizar grandemente o custo humano e o sofrimento no futuro.

Não será no melhor interesse da Eurosovigilância retirar este documento? A nossa conclusão é clara. Face a todas as tremendas falhas e erros de concepção do protocolo PCR aqui descritos, concluímos: Não resta grande escolha no quadro da integridade científica e da responsabilidade.

Fonte: O documento original está aqui: cormandrostenreview.com/report/

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